Принцип метода:
Относительная плотность мочи составляет в норме 1,015-1,025 г/см 3 . Определение относительной плотности мочи производят с помощью специальных ареометров небольшого размера, называемых урометрами. Урометры бывают двух типов: первый - для мочи с низкой и нормальной относительной плотностью (с делениями от 1,000 до 1,030 г/см 3), второй - для мочи с высокой относительной плотностью (с делениями от 1,030 до 1,060 г/см 3).
ХОД РАБОТЫ
В небольшой цилиндр с таким диаметром, чтобы урометр свободно плавал в нем, наливают по стенке исследуемую мочу и осторожно погружают в нее урометр. Производят отсчет, беря ту линию на шкале урометра, которая соответствует нижнему мениску жидкости. Все определения производят при температуре 20 0 С, поскольку шкала урометра проградуирована в соответствии с этой температурой. Если моча имеет другую температуру, то на каждые 3 0 С свыше этой температуры нужно прибавить, а на каждые 3 0 С ниже – убавить по 0,001 от показания шкалы урометра.
Обнаружение патологических компонентов мочи
1. Качественные реакции на обнаружение белка в моче – а) проба Геллера с концентрированной азотной кислотой
Принцип метода:
Концентрированная минеральная кислота НNO 3 вызывает денатурацию белка и образует комплексные соли белка с кислотой. На границе двух слоев жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца.
Ход работы
В пробирку наливают 1 мл концентрированной НNO 3 , наклоняют пробирку под углом 45 0 и осторожно по стенке пипеткой наслаивают 1мл мочи.
б) проба с концентрированной сульфосалициловой кислотой
Принцип метода:
Концентрированная органическая сульфосалициловая кислота вызывает денатурацию белка. Выпадение белка в виде осадка или мути связано с дегидратацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кислотами.
Ход работы
К 1 мл мочи приливают 3 капли 20% сульфосалициловой кислоты. При наличии белка в моче образуется белый осадок.
2. Количественное определение белка в моче с помощью
тест – полоски «Альбуфан» .
Принцип метода:
Тест основан на принципе «белковой ошибки индикатора». Реактивная зона содержит кислородный буфер и специальный индикатор, который в присутствии белков меняет цвет с желтого через зеленый до синего.
Тест высокочувствителен к альбумину и реагирует на его присутствие в моче при концентрации 0,10-0,15 г/л. Высокомолекулярные белки, такие как иммуноглобулины, измеряются с меньшей чувствительностью, чем альбумины. Низкомолекулярные белки, такие как бета-2 микроглобулин, белок Бенс -Джонса практически не выявляется этим тестом.
Оценка теста: положительным тест считается в том случае, если меняется цвет реактивной зоны. В зависимости от концентрации альбумина в моче реактивная зона может приобретать оттенок от зеленого до синего. Эти оттенки сравниваются с цветной шкалой, зоны которой соответствуют концентрации белка 0,3, 1, 3, 10 г/л.
ХОД РАБОТЫ
Тест-полоску, не касаясь реактивной зоны руками, опустить на 1-2 секунды в исследуемую мочу так, чтобы зона была смочена. Затем удалить излишки мочи с полоски и приблизительно через 1 минуту сравнить окраску зоны индикации с цветной шкалой на наборе и определить количество белка, которое выражено в г/л.
следует предварительно профильтровать.
Проба с сульфосалициловой кислотой. Наиболее чувствительной и распространенной является проба с 20% раствором сульфосалициловой кислоты.
Ход определения. Две химические пробирки помечают: «О» - опыт и «К» - контроль. В обе пробирки наливают 4-5 мл прозрачной мочи. В опытную пробирку добавляют 4-5 капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты, хорошо перемешивают. Обе пробирки рассматривают рядом на черном фоне. При наличии белка в опытной пробирке отмечается помутнение. Контрольная пробирка служит для сравнения. Чувствительность пробы с сульфосалициловой кислотой 0,015 г/л.
Продукты расщепления белка - альбумозы - также дают положительную реакцию с сульфосалициловой кислотой. Для выяснения причины помутнения пробу нагревают. При этом помутнение, вызванное присутствием альбу-моз, исчезает, а помутнение, вызванное присутствием белка, усиливается.
Кольцевая проба Геллера. Ход определения. В центрифужную пробирку наливают 1 - 1,5 мл 50% азотной кислоты или реактива Ларионовой. Затем наслаивают на
кислоту такое же количество мочи, так, чтобы жидкое не смешивались. При наличии белка на границе жидкосте] возникает белое кольцо. Реакцию оценивают на черном фоне и учитывают время появления нитевидного кольца Чувствительность пробы 0,033 г/л. При таком содержании белка на границе жидкостей появляется белое нитевидное кольцо между 2-й и 3-й минутами.
Техника наслаивания. Мочу всегда наслаивают на кислоту, так как относительная плотность мочи ниже, чем кислоты. Наслаивание производят пастеровской пипеткой с баллоном, которой набирают небольшое количество мочи. Затем мочу вносят в узкую часть центрифужной пробирки, держа ее наклонно, наслаивают по каплям, медленно опуская мочу по стенкам пробирки.
Недостаток пробы заключается в появлении пигментного кольца от окисления урохрома азотной кислотой, Это коричневатое кольцо может мешать определению. В моче, содержащей ураты, иногда появляется беловатое кольцо выше границы жидкостей.
Более четкий результат пробы Геллера получается, если вместо 50% раствора азотной кислоты используют реактив Ларионовой (1% раствор азотной кислоты насыщенном растворе хлорида натрия).
Количественное определение
Количество белка в моче можно определить двумя способами: 1) методом Брандберга-Робертса - Столь-никова с разведением мочи; 2) по помутнению, образующемуся при добавлении 3% сульфосалициловой кислоты.
Метод Брандберга - Робертса - Стольникова. В основу этого метода положена кольцевая проба Геллера. Известно, что при содержании белка в моче в количестве 0,033 г/л образуется нитевидное кольцо на 2-3-й минуте Если белка в моче содержится больше, чем 0,033 г/л, то кольцо появляется раньше, причем не нитевидное широкое. Такую мочу следует развести дистиллированной водой и вновь уже с разведенной мочой проделать наслоение на азотную кислоту. Если после наслоенш появляется нитевидное кольцо между 2-й и 3-й минутами, то разведение следует считать законченным. Количество белка в этом случае определяют, умножая 0,033 г/л нг степень разведения мочи. Разведение мочи подбирают пользуясь следующей ориентировочной оценкой свойст! кольца: если после наслаивания сразу появилось нитевидное кольцо, мочу разводят в 2 раза, если сразу появилос1 широкое кольцо-в 4 раза, если сразу появилось компак тное кольцо-в 8 или 10 раз.
Разведение мочи делают в мерной центрифужной робирке, наливая мочу до метки 1 мл и доливают водой до той метки, во сколько раз делается разведение. Содержимое пробирки тщательно перемешивают пастеровской пипеткой с баллоном.
Иногда приходится разводить мочу несколько раз. В этом случае при подсчете количества белка учитывают все разведения. Пример. При наслаивании цельной мочи появилось сразу компактное кольцо. Разводят мочу в мерной центрифужной пробирке в 10 раз (1 мл мочи и 9 мл воды до метки 10). Наслаивают разведенную в 10 раз мочу на азотную кислоту. Если сразу появляется широкое кольцо, то определение не закончено, его следует продолжить. Из первого разведения в 10 раз необходимо сделать еще разведение в 4 раза. Общая степень разведения в этом случае будет равна 40 (10x4). С разведенной в 40 раз мочой вновь ставят кольцевую пробу Геллера. При появлении нитевидного кольца между 2-й и 3-й минутами определение следует считать законченным.
При работе можно пользоваться поправкой Эрлиха- Альтгаузена, в случае, если нитевидное кольцо появляется ранее 2-й минуты. Чтобы не разводить мочу дополнительно, авторы предложили определить время появления нитевидного кольца и внести в расчет поправку на время. В этом случае количество белка рассчитывают умножая 0,033 г/л на степень разведения и на поправку. Значения поправок сведены в табл. 3.
Таблица 3. Значения поправок для определения белка
Время образования" Поправка кольца, мин Время образования Поправка кольца, мин
Проба Геллера , по имени австр. патолога И. Ф. Геллера (J.F. Heller), распространенное название качественной реакции на белок в моче . Проба имеет чувствительность 0,033 г/л и используется в клинической диагностике протеинурии . Принцип выявления белка основан на его денатурации под воздействием денатурирующего фактора - концентрированной азотной кислоты или реактива Ларионовой.
Следует отметить, что в моче всегда присутствует некоторое количество белка, но, как правило, его концентрация в моче здорового человека ниже порога чувствительности качественной реакции и не выявляется простыми методами. Для количеств белка свыше 0,033 г/л проба непригодна. При более высоких концентрациях необходимо разбавлять мочу или использовать альбуминометр Эсбаха.
Для определения количества общего белка в моче используются метод, основанный на пробе Геллера - метод Брандберга-Робертса-Стольникова (W. Roberts, 1830-1899, англ. терапевт). Методика предполагает разведение мочи до нижнего предела чувствительности пробы (0,033 г/л) и времени образования кольца в 2-3 минуты.
Ход выполнения анализа
Реактивы: концентрированная (дымящаяся) азотная кислота или реактив Ларионовой. Исследуемая моча должна быть прозрачной и иметь кислую реакцию.
Приготовление реактива Ларионовой
Приготавливают насыщенный раствор хлорида натрия (20-30 г соли растворяют в 100 мл теплой воды, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают и фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты (можно заменить 2 мл соляной кислоты).
Техника исследования
В пробирку с 1-2 мл реактива осторожно по стенке наслаивают примерно такое же количество мочи. При наличии белка, примерно через 2-3 минуты, на границе раздела жидкостей наблюдается помутнение - белое кольцо из денатурировашего белка.
Ложноположительный результат может появиться при использовании азотной кислоты, за счет высокой концентрации нуклеоальбуминов или солей уратов. В первом случае оно исчезает при легком покачивании пробирки, а во втором кольцо располагается значительно выше границы раздела сред и исчезает при нагревании; при повторении пробы с разбавленной мочой кольцо не образуется. Иногда также появляется коричневатое пигментное кольцо от окисления урохрома азотной кислотой.
Кольцевая проба Геллера помогает проанализировать белковую составляющую мочи. Данный метод, разработанный Иосифом Геллером, базируется на физико-химическом процессе слипания. Для мочи требуется определенное состояние: при исследовании нужен прозрачный образец , который обладает кислой реакцией.
Для исследования используется концентрат азотной кислоты HNO3. Также под данный метод подойдет реактив Ларионовой. Чтоб изготовить его, подготавливается раствор хлористого натрия в концентрированном состоянии: двадцать пять миллиграмм соли добавляют в сто миллилитров воды.
Далее жидкость нагревают, при этом происходит полное растворение соли . После того, как раствор остывает, надосадочную составляющую удаляют и девяносто девять миллилитров объединяют с одним миллилитром концентрата HNO3. Его также можно заменить двумя миллилитрами концентрата хлористоводородной кислоты.
Алгоритм проведения
Для пробы Геллера потребуется пробирка, в которую помещается реактив в объеме от одного до двух миллилитров. Далее очень осторожно по стенке сосуда добавляется исследуемая моча в равной пропорции с реактивом. По прошествии трех минут взаимодействия присутствие белка проявится в виде мутной пограничной линии между мочой и реактивом. Это кольцо и является белковым денатуратом.
Ложный положительный эффект изучения может возникнуть в случае применения азотной кислоты, а также при большом количестве нуклеоальбуминов или же солей уратов. В первой ситуации кольцо растворяется, если слегка встряхнуть пробирку. Вторая ситуация предполагает наличие кольца, которое будет локализоваться немного выше разделяющей черты. Оно растворяется при повышении температуры жидкости. В некоторых случаях возникает кольцо коричневого окраса, это результат окисления урохрома азотной составляющей.
Сравнивая эффект от применения HNO3 и реактива Ларионовой, хочется отметить второй вариант как более точный. Он обладает рядом преимуществ:
- Реактив Ларионовой не дает при анализе пигментные кольца.
- Белковые кольца проявлены более четко, чем с использованием метода Геллера.
- Сохраняется азотная кислота.
- Реактив не так опасен и, оказываясь на ткани, не прожигает ее.
Минусы при использовании пробы
- Использование пробы Геллера — довольно сложный процесс, для которого требуется довольно много времени, а также концентрат азотной кислоты.
- Может возникать пигментное кольцо коричневого окраса, что препятствует выявлению белка.
- В материале, в котором есть соль мочевой кислоты, может образовываться белое кольцо, располагающееся значительно выше линии, которая разделяет жидкости.
- Также исследование способно давать ложные положительные результаты в случае большого количества мочевой кислоты.
Альтернатива
Быстрый и более простой способ определения белка в моче — с помощью специальной бумаги, которая является индикатором.
В этом варианте исследования в материал погружается бумажная полоска, которая содержит в себе особую пропитку, благодаря чему индикаторная бумага при контакте с мочой приобретает цвет в диапазоне от желтого к синему. Оттенок указывает концентрацию белка. Существует шкала, по которой можно сделать данное заключение.
Для того чтобы результат был максимально точным, следует придерживаться некоторых правил:
- рН материала должен находиться на отметке от 3,0 до 3,5 . Большое количество щелочи даст ложный положительный результат, а в случае большого количества кислоты в моче – ложный отрицательный.
- Бумажный индикатор не должен контактировать с материалом больше положенного времени. Иначе результат будет необъективным.
- Также при слишком большом количестве слизи может быть ложный положительный результат.
- В зависимости от бумаги и ее производителя чувствительность индикатора может быть разной. Так что не следует полностью полагаться на данный тест в отношении содержания белка в моче.
- Суточная моча не может показать количество белка.
Принцип выявления белка основан на его денатурации под воздействием денатурирующего фактора - концентрированной азотной кислоты или реактива Ларионовой.
Следует отметить, что в моче всегда присутствует некоторое количество белка, но, как правило, его концентрация в моче здорового человека ниже порога чувствительности качественной реакции и не выявляется простыми методами. Для количеств белка свыше 0,033 г/л проба непригодна. При более высоких концентрациях необходимо разбавлять мочу или использовать альбуминометр Эсбаха.
Для определения количества общего белка в моче используются метод, основанный на пробе Геллера - метод Брандберга-Робертса-Стольникова (W. Roberts, 1830-1899, англ. терапевт). Методика предполагает разведение мочи до нижнего предела чувствительности пробы (0,033 г/л) и времени образования кольца в 2-3 минуты.
Ход выполнения анализа
Реактивы: концентрированная (дымящаяся) азотная кислота или реактив Ларионовой. Исследуемая моча должна быть прозрачной и иметь кислую реакцию.
Приготовление реактива Ларионовой
Приготавливают насыщенный раствор хлорида натрия (20-30 г соли растворяют в 100 мл теплой воды, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают и фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты (можно заменить 2 мл соляной кислоты).
Техника исследования
В пробирку с 1-2 мл реактива осторожно по стенке наслаивают примерно такое же количество мочи. При наличии белка, примерно через 2-3 минуты, на границе раздела жидкостей наблюдается помутнение - белое кольцо из денатурировашего белка.
Ложноположительный результат может появиться при использовании азотной кислоты, за счет высокой концентрации нуклеоальбуминов или солей уратов. В первом случае оно исчезает при легком покачивании пробирки, а во втором кольцо располагается значительно выше границы раздела сред и исчезает при нагревании; при повторении пробы с разбавленной мочой кольцо не образуется. Иногда также появляется коричневатое пигментное кольцо от окисления урохрома азотной кислотой.
Использование реактива Ларионовой, в отличие от азотной кислоты, имеет ряд преимуществ: на границе наслоения не образуется пигментных колец, а положительный результат дает более четкие белковые кольца.
См. также
Ссылки
Литература
Wikimedia Foundation . 2010 .
Смотреть что такое "Проба Геллера" в других словарях:
ГЕЛЛЕРА ПРОБА - на белок (Heller), основана на осаждении белка азотной к той. Если налить в пробирку несколько куб. ем концентрированной (дымящейся) азотной кислоты и поверх нее осторожно наслаивать исследуемую жидкость так, чтобы оба слоя не смешались, то, в… … Большая медицинская энциклопедия
ГЕЛЛЕРА ПРОБА - [по имени австрийского патолога И. Ф. Геллера (J. F. Heller)], реакция качественного определения белка в моче. Основана на свёртывании белка под действием кислот. На 12 мл 50% ного раствора азотной кислоты осторожно наслаивают такое же… … Ветеринарный энциклопедический словарь
- (Urin, Urina, Lotium) жидкость, выделяемая почками; она выносит преимущественно азотистые продукты распада белковых веществ как органов, так и соков тела, а именно: мочевину, мочевую кислоту, креатинин и др.; ей выводятся также и серно кислые… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона